Pembuatan Preparat Parafin Jaringan Tumbuhan (Mikroteknik)

Banyak cara dalam pembuatan preparat jaringan tumbuhan, diantaranya adalah dengan metode parafin. Metoda ini sekarang banyak digunakan, karena hampir semua macam jaringan dapat dipotong dengan baik bila menggunakan metoda ini. Kebaikan-kebaikan metoda ini adalah irisan yang dihasilkan jauh lebih tipis dari pada menggunakan metoda beku atau metoda seloidin. Dengan metoda beku, tebal irisan rata-rata diatas 10 mikron, tapi dengan metode paraffin tebal irisan dapat mencapai rata-rata 6 mikron. Irisan-irisan yang bersifat seri dapat dikerjakan dengan mudah bila menggunakan metode ini. Prosedurnya jauh lebih cepat dibandingkan dengan metode seloidin. Namun metode paraffin juga memiliki kelemahan yaitu jaringan menjadi keras, mengerut dan mudah patah. Jaringan-jaringan yang besar tidak dapat dikerjakaan, bila menggunakan metode ini. Sebagian besar enzim-enzim akan larut dengan medode ini (Suntoro, 1983).


Metode paraffin merupakan cara pembuatan sediaan dengan menggunakan paraffin sebagai media penanamna (embedding). Langakah-langkah dalam pembuatan sediaan tersebut adalah (Tim MITEK Tumbuhan, 2002):

1. Pematian dan fiksasi: Banyak larutan yang dapat digunakan untuk fiksasi, diantaranya adalah larutan FAA (Formaldehyde Acetic-acid Alcohol), dengan komposisi sebagai berikut: 50% atau 70% etilalkohol 90 cc, Asam asetat glacial 5 cc Formalin 40 % 5 cc. Setelah bahan dipotong kira-kira 0,5 cm segera dimasukkan ke dalam larutan FAA dengan perbandingan 1: 20 (bahan 1/20 volume FAA), tidak boleh lebih delapan potong didalam vial. Lama fiksasi dalam FAA bagi bahan yang kecil atau tipis minimum 12 jam sedangkan untuk bahan yang besar atau tebal 24 jam.
2. Aspirasi: Aspirasi dilakukan dengan menggunakaan vakum (aspirator) dan digunakan dengan interval waktu yang pendek dan berkali-kali, dapat juga dengan menggunakan spet suntik. .
3. Pencucian: Pencucian dilakukan 2 kali dalam waktu 3 jam dengan akohol 50%. Jumlah larutan dipakai hannya tepat menutupi bahan. 
4. Dehidrasi dengan TBA (Tertier Butil Alkohol), serta infitrsi: Dehidrasi dilakukan dengan campuran etilalkohol dan TBA dalam konsentrasi tertentu yang masing-masing dinamai larutan Johansen I sampai V.
5. Penanaman (Embedding): Buat kotak keras yang agak tebal dengan ukuran kira-kira 5 X 2,5 X 2 cm- (panjang X lebar X tinggi), lalu isi dengan paraffin keras yang cair dalam vial tadi, kemudian sebelum paraffin membeku masukkan bahan. Atur bahan tersebut dalam kotak kertas dengan menggunakan jarum yang dipanaskan dengan lampu alcohol atau spritus dan beri label. Setelah paraffin membeku dan bahan tidak bergoyang, letakkan kotak kertas dalam air dingin. Biarkan permukaan paraffin membeku, kemudian tekanlah seluruh kotak kedalam air sampai paraffin membeku, atau dapat juga dimasukkan kedalam freezer sampai seluruh paraffin sama sekali membeku. Baru setelah itu paraffin dapat dikeluarkan dari kotaknya.
6. Penyayatan: Potong balok paraffin menjadi balok-balok kecil yang masing-masing mengandung sebuah bahan. Balok-balok paraffin itu ditempelkan pada balok kayu menurut arah sayatan yang dikehendaki. Penempelan dilakukan dengan mencairkan sebagian balok paraffin dengan jarum yang telah dipanasi, kemudian meletakkan balok paraffin pada kayu. Lakukan hal itu beberapa kali sehingga balok paraffin menempel dengan kuat pada balok kayu. Permukaan dari balok paraffin yang telah ditempelkan sebaiknya empat persegi atu bujur sangkar. Perhatikan bahwa sisi horizontal harus benar-benar sejajar. Bahan yang ada dalam balok paraffin disayat dengan mikrotom putar (rotary microtome). Sebelum dipotong balok yang telah ditempeli bahan dan pisau didinginkan dahulu dengan air dingin (kulkas), sehingga suhu paraffin sama dengan suhu pisau. Balok kayu yang telah ditempel dengan balok paraffin dipasang pada pemegang yang terdapat pada mikrotom. Aturlah tebal sayatan (biasanya antara 6-15 mikron) dengan memutar skrup pada sisi kanan mikrotom. Pasang pisau pada mikrotom. Pada waktu pemutar mikrotom dijalankan, bahan dalam paraffin yang telah diletakkan pada pemegang bergerak naik turun dan maju kedepan. Peganglah sayatan-sayatan paraffin yang berbentuk pita itu dengan kuas halus. Pita paraffin hasil sayatan disimpan pada kotak karton atau baki preparat. Sebaiknya pemotongan dilakukan di ruangan ber-AC.
7. Penempelan sayatan: Cara penempelan adalah sebagai berikut:

• Teteskan larutan perekat pada kaca obyek sebesar tetesan kecil, gosok perekat tersebut sampai rata pada kaca obyek dengan ujung jari hingga membentuk lapisan tipis.
• Teteskan larutan formalin diatas kaca obyek yang telah diberi perekat tadi. Letakkan sayatan diatasnya, dan letakkan kaca obyek tersebut diatas papan pemanas selama 30 menit. Usahakan agar sayatan paraffin merata pada permukaan kaca obyek. Amati dibawah mikroskop diseksi. Periksa apakah sayatan bahan telah rata benar.
• Isaplah kelebihan larutan formalin yang terdapat pada sisi sayatan dengan kertas pengisap.

      8. Pewarnaan: Untuk mewarnai bahan yang telah ditempel tersebut adalah dengan cara merendamkan kaca obyek tersebut kedalam bejana pewaarna (bejana coplin), biasanya dibutuhkan bejana coplin tersebut kira-kira 12 buah, tergantung dengan pewarna yang kita pakai. Masing-masing bejana diberi label dengan nama zat yang berada didalamnya, demikian pula dengan tutupnya.
Pewarnaan Safranin - Fast Green:
Xilol 100 % 2 -5 menit
Alkohol 100 % 2 -5 menit
Alkohol 95 % 2 -5 menit
Alkohol 70 % 2 -5 menit
Safranin 1 % dalam Alkohol 70 % 12 jam – 1 malam
Alkohol 95 % 2 -5 menit
Fast green 0,1 % dalam Alkohol 95 % 5 – 15 detik
Alkohol 100 % I 2 -5 menit
Alkohol 100 % II 2 -5 menit
Alkohol 100 % : Xilol 100 % 1: 1 2 – 5 menit
Xilol I 2 – 5 menit
Xilol I 2 – 5 menit
Diperiksa dibawah mikroskop apabila sudah terlihat warna yang kontrase baik maka diberi canada balsam lalu ditutup dengan kaca penutup.

berikut ini adalah salah satu hasil dari pengamatan jaringan tumbuhan yang sudah di jadikan preparat

untuk penjelasan yang lebih lengkap mengenai metode pembuatan preparat parafin jaringan tumbuhan ini, silakan download file lengkapnya (pdf) dengan mengikuti link di bawah ini...


DOWNLOAD FILE: PARAFIN TUMBUHAN

Selamat belajar!!!...

Ingat, piracy is a CRIME!!!....

Tulisan Terkait