1. Protein Antiserum
Protein berperan penting dalam struktur dan fungsi semua sel, baik itu makhluk hidup tingkat tinggi maupun rendah serta virus. Kebanyakan protein merupakan enzim atau subunit enzim. enzim juga berperan dalam fungsi struktural maupun mekanis, contohnya protein yang membentuk batang dan sendi sitoskeleton.
Protein terlibat dalam sistem kekebalan sebagai antibodi, sistem kendali (hormon), sebagai komponen penyimpanan (dalam biji), dasn juga dalam transportasi hara. Sebagai salah satu sumber gizi, protein berperan sebagai sumber asam amino tersebut (heterotrof) (Page, 1997). Protein mempunyai peranan cukup penting dalam hampir semua sistem seluler. Protein bertanggung jawab pada berbagai fungsi fisiologis seperti katalis enzimatis, transportasi, penyimpanan molekul lainnya, pergerakan di dalam sel maupun antar sel, serta sebagai supporter atau pendukung mekanik. Keberadaan protein dapat diidentifikasi melalui teknik kromatografi, isolasi, dan purifikasi (White, 1964). Beberapa jenis protein tersebut juga sangat berperan dalam sistem imunitas makhluk hidup.
Immunitas adalah salah satu terminologi dalam ilmu biologi yang menggambarkan atau menjelaskan suatu keadaan pertahanan biologis tercukupi oleh suatu makhluk hidup untuk menghindarkannya dari berbagai macam penyakit, infeksi, atau invasi komponen biologis yang tidak diharapkan dalam tubuh. Imunitas dapat berupa komponen spesifik ataupun non-spesifik. Komponen non-spesifik tersebut berperan baik sebagai barrier atau penghalang maupun sebagai eliminator patogen yang berbahaya yang bersifat wide range. Sedangkan komponen lainnya beradaptasi terhadap masing-masing penyakit baru yang masuk dalam tubuh dan mampu mendorong terjadinya imunitas pathogen spesifik. Salah satu materi yang dapat membawa komponen tersebut adalah antiserum.
Antiserum adalah serum dari manusia atau hewan yang mengandung antibody untuk melawan berbagai macam penyakit yang spesifik dan biasanyan memberikan imunitas pasif kepada penyakit tersebut. Antiserum tidak menyebabkan produksi antibodi dan da dua macam antiserum, yaitu antitoksin yang menetralkan toksin yang dihasilkan oleh bakteri spesifik namun tidak membunuh bakteri tersebut, dan jenis antiserum lainnya adalah serum antimikrobial yang dapat menghancurkan mikrobia dengan cara membuat bakteri menjadi lebih rentan terhadap aksi leukosit.
Setiap kajian yang berhubungan dengan penanganan hewan untuk produksi antibodi selalu mengikuti prosedur standar yang melibatkan inokulasi material antigenik ke dalam tubuh hewan coba, dan kemudian dilakukan pengambilan antiserum yang ada dalam tubuh hewan tersebut.
2. Isolasi Protein Antiserum dengan Metode Salting Out
Isolasi protein digunakan untuk mendapatkan protein dengan melalui pemisahan protein dari komponen penyusun sel yang lainnya atau jaringan. Salah satu sifat protein yaitu mudah terlarut dalam air, sehingga dapat digunakan deterjen untuk dapat memisahkan komponen lainnya. Bahan yang biasa digunakan yaitu Sodium Dodecyl Sulphate (SDS). Deterjen ini memiliki kemampuan untuk merusak membran sel dengan cara berikatan dengan membran yang berupa lapisan fosfo lipid bilayer serta melartukan lemak dan protein. Sentrifugasi juga digunakan untuk mengisolasi protein dengan menggunakan kecepatan dan waktu tertentu sehingga tiap molekul protein yang berbeda dapat dipisahkan satu sama lain. Hal ini berdasarkan prinsip kerja sentrifugasi yang memisahkan molekul berdasarkan perbedaan berat molekul (Lodish, dkk., 2000).
Protein yang terdenaturasi akan berkurang kelarutannya. Lapisan molekul protein bagian dalam yang bersifat hidrofobik akan keluar, sedangkan bagian protein yagn bersifat hidrofilik akan terlipat ke dalam. Pelipatan atau pembalikan terjadi bila larutan protein mendekati pH isoelektris, lalu protein akan menggumpal dan mengendap. Viskositas akan bertambah karena molekul mengembang dan menjadi asimetrik, sudut putaran optis larutan protein juga akan meningkat. Denaturasi protein dapat disebabkan oleh panas, pH, bahan kimia, mekanik, dan lain-lain (Winarno, 1992).
Protein akan mengalami presipitasi jika berinteraksi dengan ion-ion logam. Pengendapan oleh ion positif (logam) diperlukan pH larutan diatas pI karena protein bermuatan negatif. Pengendapan protein oleh ion negatif diperlukan pH larutan di bawah pI karena protein bermuatan positif. Ion-ion positif yang dapat mengendapkan protein adalah Ag+, Ca++, Zn++, Hg++, Fe++, Cu++, dan Pb++, sedangkan ion-ion negatif yang dapat mengendapkan protein adalah ion salisilat, trikloroasetat, pikrat, tanat, dan sulfosalisilat (Poedjiadi, 1994).
3. Reaksi Antigen-Antibodi
Reaksi antigen-antibodi dapat diketahui dengan menggunakan metode Dot Blot. Dot Blot adalah sebuah teknik untuk mendeteksi, menganalisis, dan mengidentifikasi protein. Teknik ini menyerupai Western Blot namun perbedaannya adalah protein sampel tidak dipisahkan melalui elektroforesis akan tetapi ditandai dengan template sirkuler secara langsung pada substrat kertas. Konsentrasi protein dalam preparasi mentah atau kasar (misalnya kultur supernatan) dapat diperkirakan secara semikuantitatif dengan menggunakan teknik ini jika dimiliki protein yang terpurifikasi dan antibodi untuk protein tersebut.
Beberapa langkah yang harus dikerjakan dalam proses Dot Blot adalah menyiapkan membran, dan menandainya dengan grid menggunakan pensil untuk mengindikasikan daerah yang akan di blot. Sampel yang akan diuji diteteskan pada membran nitroselulosa pada bagian tengah kisi (grid) yang telah digambar pada membran tersebut dan dibiarkan kering. Situs yang tidak spesifik kemudian diblok dengan merendam membran dalam Bovine Serum Albumin (BSA) dan diinkubasi dalam antibodi primer selama 30 menit suhu ruang. Langkah berikutnya adalah pencucian dengan PBS-T selama kurang lebih 3 kali masing-masing 5 menit dan dinkubasi pada antobodi sekunder yang terkonjugasi dengan HRP. Pencucian dilakukan kembali setelah proses tersebut selesai dan dipaparkan pada film X-ray pada ruang gelap. (Nature Publishing Group, 2009)
Selamat Belajar!!...
0 comments:
Post a Comment