IDENTIFIKASI GEN TARGET SPESIFIK DENGAN SOUTHERN DAN DOT BLOT

Deoxyribose Nucleic Acid (DNA) total dari suatu organisme (genom) atau kandungan RNA seluler dari RNA adalah suatu campuran kompleks sekuens asam nukleat yang berbeda. Komponen-komponen tersebut sangat perlu untuk dibedakan sehingga dapat dilakukan analisis. Beberapa teknik telah dikembangkan dengan tujuan untuk mengatasi masalah tersebut, yaitu mengidentifikasi asam nukleat spesifik dalam kompleks asam nukleat, antara lain Southern Blot dan Dot Blot.

Southern Blot adalah metode umum yang digunakan untuk identifikasi fragmen DNA yang berkomplementer untuk mengetahui sekuens DNA. Hibridisasi ini memungkinkan untuk dilakukan pembandingan antara genom organisme tertentu dengan probe. Sehingga dapat memberikan keterangan apakah organisme tersebut memiliki gen tertentu dan menyediakan informasi tentang pengaturan dan pemetaan daerah pemotongan dari gen tersebut, sedangkan Dot Blot adalah metode penempelan protein atau asam nukleat secara langsung pada membran.

Sampel yang terlarut ditarik melalui membran baik menggunakan lingkungan yang vakum, maupun absorpsi dan intrusi, sehingga protein berikatan dengan membran sedangkan komponen lainnya dapat melewati membran. Protein tersebut dapat digunakan untuk berbagai macam analisis. Proses Blotting ini sangat diperlukan untuk membedakan fragmen secara spesifik karena pemendekan oleh restriksi kompleks genom dapat menciptakan jutaan fragmen restriksi spesifik dan ada beberapa fragmen yang ukurannya sama dan tidak akan terpisah antara satu dengan yang lainnya jika menggunakan elektroforesis, sehingga perlu adanya metode untuk memisahkan fragmen spesifik tersebut dari fragmen yang lainnya

Southern Blot

Southern Blot adalah teknik yang mampu untuk mendeteksi fragmen restriksi tunggal yang spesifik dalam campuran asam nukleat yang sangat kompleks yang dihasilkan dari pemotongan genom dengan menggunakan enzim restriksi. Kompleks dalam campuran tersebut, banyak fragmen yang akan mempunyai panjang yang sama dengan yang lain dan bermigrasi atau berpindah bersama-sama selama proses elektroforesis. Meskipun semua fragmen tidak secara sempurna terpisah oleh proses elektroforesis gel agarose, fragmen tunggal dalam pita hasil elektroforesis dapat diidentifikasi dengan hibridisasi menggunakan DNA probe yang spesifik. Sehingga untuk menyelesaikan masalah tersebut, fragmen restriksi yang ada dalam gel didenaturasi dengan alkali dan ditransfer pada filter nitroselulosa atau membran nilon dengan teknik blotting (Brown, 2001).

Langkah-langkah umum yang digunakan dalam metode Southern Blotting antara lain, fragmen DNA dalam gel didenaturasi, yaitu diseparasi menjadi struktur untai tunggal menggunakan larutan alkali dan dilakukan elektrotransfer (DNA berpindah dari gel menuju filter). Gel yang terdenaturasi ditempatkan pada lembaran kertas filter dan dibenamkan dalam larutan buffer. Sebuah membran nitroselulosa diletakkan di atas gel dan beberapa kertas filter yang kering diletakkan di atas membran tersebut. Larutan buffer bergerak dan berpindah tempat melewati gel, tertarik oleh kertas filter kering. Buffer tersebut membawa DNA untai tunggal di dalamnya dan ketika DNA mencapai nitroselulosa, DNA tersebut berikatan dengan membran dan terimobilisasi dalam posisi yang sama dengan posisi relatif dimana DNA termigrasi dalam gel.

DNA terikat secara irreversible pada filter atau membran oleh proses pemanasan (baking) pada temperatur yang tinggi (nitroselulosa) atau cross-linking menggunakan sinar ultraviolet (nilon). Tahapan terakhir adalah merendam membran di dalam larutan yang mengandung probe, baik DNA (klon cDNA, fragmen genom, oligonukleotida) atau RNA. Hibridisasi DNA ini, dengan kata lain DNA target dan DNA/RNA probe membentuk hybrid karena keduanya merupakan sekuens komplementer dan dapat berikatan satu sama lain. Probe yang digunakan biasanya adalah yang terlabel secara radioaktif dengan¬¬¬ 32P (¬β-particle emitter berenergi tinggi), seringkali dengan penghilangan ujung phosphat 5’ dari probe dengan alkali phosfatase dan penggantian dengan radiolabelled phosphate menggunakan γ-[32P]ATP dan polinukleotida kinase (PNK). Membran dicuci untuk menghilangkan probe yang tidak spesifik berikatan dan kemudian dipaparkan pada film X-ray yang prosesnya disebut dengan autoradiografi. Pada posisi dimana probe berikatan, β-emmisions dari probe menyebabkan film ¬X-ray menjadi hitam. sehingga memungkinkan untuk identifikasi ukuran dan jumlah fragmen gen kromosomal dengan kesamaan yang kuat dengan gen atau fragmen gen yang digunakan sebagai probe (Lutz, 2003).

Dot Blot

Dot Blot adalah sebuah teknik untuk mendeteksi, menganalisis, dan mengidentifikasi protein. Teknik ini menyerupai Western Blot namun perbedaannya adalah protein sampel tidak dipisahkan melalui elektroforesis akan tetapi ditandai dengan template sirkuler secara langsung pada substrat kertas. Konsentrasi protein dalam preparasi mentah atau kasar (misalnya kultur supernatan) dapat diperkirakan secara semikuantitatif dengan menggunakan teknik ini jika dimiliki protein yang terpurifikasi dan antibodi untuk protein tersebut.

Beberapa langkah yang harus dikerjakan dalam proses Dot Blot adalah menyiapkan membran, dan menandainya dengan grid menggunakan pensil untuk mengindikasikan daerah yang akan di blot. Sampel yang akan diuji diteteskan pada membran nitroselulosa pada bagian tengah kisi (grid) yang telah digambar pada membran tersebut dan dibiarkan kering. Situs yang tidak spesifik kemudian diblok dengan merendam membran dalam Bovine Serum Albumin (BSA) dan diinkubasi dalam antibodi primer selama 30 menit suhu ruang. Langkah berikutnya adalah pencucian dengan PBS-T selama kurang lebih 3 kali masing-masing 5 menit dan dinkubasi pada antobodi sekunder yang terkonjugasi dengan HRP. Pencucian dilakukan kembali setelah proses tersebut selesai dan dipaparkan pada film X-ray pada ruang gelap.

1. Cara Transfer DNA ke Membran Nilon

Gel agarosa hasil elektroforesis dan membran nilon didenaturasi di larutan, dan denaturasi dilakukan selama 5 menit pada suhu ruang. Baki buffer disiapkan untuk transfer kapilari, kertas Whatman 3MM, membran nilon, setumpuk tissue yang tidak mudah rusak bila terkena cairan, dan pemberat 500 mg, dan disusun sedemikian rupa dengan urutan dari bawah ke atas: baki buffer-kertas Whatman-gel agarosa-membran-kertas Whatman-kertas tissue-pemberat. Ditambahkan buffer transfer di dalam baki sampai kertas Whatman 3MM basah oleh buffer tersebut. Gel agarosa diletakkan di atasnya dan membran nilon yang telah dibasahi buffer di atas gel dan diratakan posisinya. Baki ditutup kecuali pada daerah gel dan membran nilon dengan plastik wrap agar buffer tidak cepat menguap. Ditutup dengan kertas Whatman selebar gel ditambah 1 cm setiap sisinya dan dibasahi dengan buffer transfer, diratakan posisinya dan ditutup dengan setumpuk tissue dan kemudian diberi pemberat. Langkah berikutnya adalah inkubasi pada suhu ruang dan dijaga buffer agat tidak habis menguap, dan bila habis segera diisi buffer di baki buffer. Setelah 12 jam, semua tissue dibuang, diambil hati-hati membran nilon dari atas gel dan dikeringkan 2-5 menit di atas tissue kering. Cross-link dilakukan di bawah sinar UV selama 1-2 menit agar DNA dapat melekat pada membran. Membran kemudian disimpan sampai dilakukan proses hibridisasi.


2. Cara Kerja Dot Blot DNA

Sampel DNA dimasukkan dalam Eppendorf dengan dibuat seri pengenceran 1ng/µL, 100 pg/µL, 50 pg/µL, 1 pg/µL, 0,1 pg/µL, 0 pg/µL dan dilarutkan sampai volume 20 µL dengan 6µL 20xSSC fsn 18 µL DW. Sampel cDNA/DNA terlabel didenaturasi selama 10 menit pada suhu 95°C kemudian segera diambil dan dimasukkan dalam es agar tidak terjadi reannealing. Membran NC dipasang pada dot blotter dan sebanyak 1µL DNA/cDNA terlabel (terdenaturasi) diaplikasikan pada dot blotter. Dot-blotter dihubungkan dengan vacuum pump selama 15-30 menit sampai semua sampel menempel pada NC. Sampel diimobilisasi dengan cara menginkubasi NC dalam oven pada suhu 100°C selama 30 menit. Membran NC direhidrasi dalam DW beberapa menit pada suhu 37°C.

3. Visualisasi dengan DNA/cDNA Terlabel Biotin Menggunakan SA-HRP dan AEC


Membran NC dimasukkan dalam ke dalam kantong plastik klip yang berisi SA-HRP (streptavidin-horseradish peroksidase) 1:1000 dalam PBS, diinkubasi selama 1 jam pada suhu ruang atau 20 menit pada 37°C. Membran NC diinkubasi dalam PBS 2x5 menit dan membran tersebut dimasukkan dalam kantong plastik klip kemudian ditambah 5-10ml AEC (aminoethylcarbazole), diinkubasi pada suhu ruang selama 30 menit atau terbentuk warna merah.

Stok solution AEC: 0,4 gram AEC dilarutkan dalam 100ml dimethilformamide (DMF). Stok solution stabil selama 1 tahun pada suhu ruang. Sebelum dipakai, 0,67 Ml AEC stok solution ditambah 10ml 0,1M sodium asetat (Ph 5,2), distirer dan disaring, san ditambah 10µL 30% H2O2. Reaksi dihentikan dengan cara dicuci dalam PBS 2x5 menit, dan dicuci dengan DW kemudian dikeringkan.

Untuk keterangan lebih jelas tentang hasil dan pembahasan, silakan ikuti link di bawah ini untuk mendownload file .doc nya..

DOWNLOAD FILE

Tulisan Terkait